鱼腥草抑制鸡毒支原体感染有效部位的筛选及其免疫学机理研究

【摘要】支原体是已知的能白行增殖的生物中最小的一类微生物,宿主范围广泛,包括人、动物、昆虫和植物,其引起的呼吸道疾病,严重影响人类和动物健康。这类疾病的显著标志是引起免疫抑制,造成机体持续的支原体感染和呼吸道慢性炎症过程。鱼腥草,味辛,性微寒,归肺经,具有清热解毒、消痈排脓等功能,临床主要用于治疗痰热喘咳等肺部疾病。中医学认为疾病的发生、发展和转归取决于正邪的消长,与机体的免疫功能密切相关,因此中医提出了“扶正祛邪”的主要治病原则,按现代免疫学理论可称为“提高机体免疫功能”,体现了现代免疫学的朴素原理。目的：以鸡毒支原体作为研究对象,运用现代中药提取分离技术,提取鱼腥草的总多糖、总黄酮、挥发油三个部位,通过体内外试验研究筛选出鱼腥草抑制支原体感染的有效部位,并采用药理学方法、分子生物学方法、免疫学方法等探讨其有效部位抑制MG感染的免疫学治疗机理。充分阐明清热解毒类中药在抗感染治疗方面,既清除病原体又具有免疫调节作用,既祛邪又扶正的药理学作用,并为研制安全有效、质量可控的鱼腥草有效部位新制剂提供基础工作。方法：1.采用水提醇沉法提取总多糖；通过比较水提取、醇提取、索氏回流提取、微波辅助提取等提取方法确定总黄酮最佳提取方法,并采用正交实验优化总黄酮提取工艺；采用水蒸汽蒸馏法提取鱼腥草挥发油。并测定主要成分含量。2.通过荧光染料筛选、菌液浓度优化、染色条件和仪器方法等的优化建立流式细胞术快速药敏实验方法。用建立的方法筛选鱼腥草体外抑制鸡毒支原体的有效部位,并采用传统药敏实验法对其进行验证。3.SPF鸡胚尿囊腔接种梯度浓度的支原体菌液,人工制造发病模型,通过鸡胚发育状况、肺脏组织切片、病原学检查、血清学检查等手段验证模型的有效性。4.通过动物感染模型筛选鱼腥草抑制支原体感染鸡胚的有效部位及其发挥作用的免疫学机理。鱼腥草系列提取物给与鸡胚感染模型后,采用组织切片观察鱼腥草提取物对鸡胚肺组织的修复；采用PCR方法检测鱼腥草提取物对鸡胚肺脏组织中病原的抑制作用；采用实时荧光定量PCR法检测鱼腥草对IL-4、IL-6、IL-12、IFN-y等细胞因子的表达情况的影响；采用流式细胞术方法检测CD4+/CD8+T细胞表面抗原的表达情况,筛选出可有效抑制鸡毒支原体的有效部位并探索鱼腥草抑制鸡毒支原体感染的作用机理。结果：1.比较实验结果表明,水提法为鱼腥草总黄酮有效部位最佳提取方法,正交试验确定水提法最佳工艺条件为浸泡时间1h,提料液比1：30,提取时间90min,提取次数3次。总多糖得率为2.24%,总黄酮含量为2.54%。GC-MS鉴定水蒸气蒸馏法得到鱼腥草主要的21种挥发油,其中3个烯类化合物(4.85%),4个醛类化合物(34.04%),2个酯类物质(6.96%),2个酮类(14.73%),8个醇类(29.41%),2个酸类化合物(9.92%)。2.本研究建立了SYBR/PI,CFDA/PI两种双染色方法应用于抗鸡毒支原体中药流式细胞术药敏实验。SYBR/PI双染色法最佳工作条件为：SYBR工作稀释度1：500000,PI工作浓度1μg.mL-1,工作缓冲液PH7.4PBS,孵育时间10min。CFDA/PI双染色法最佳工作条件为：CFDA工作浓度1μM,PI工作浓度1μg.mL-1,工作缓冲液PH7.4PBS,孵育时间10min。并建立了绝对计数方法。用建立的方法筛选得到挥发油为鱼腥草体外抑制鸡毒支原体生长的有效部位。与传统纸片法药敏试验结果一致。3.建立了鸡毒支原体感染鸡胚模型。从鸡胚发育状况、组织切片、病原学检验、血清学检验的结果显示：中剂量感染组鸡胚活动减弱,死亡率低(17%),病理切片结果表明肺组织支气管充血,轻微水肿,PCR检测肺组织鸡毒支原体感染情况,该组样品均为阳性。确定中剂量为鸡毒支原体感染鸡胚模型的最佳攻毒剂量,即为尿囊腔接种100μL/只,菌液浊度为2×108ccu·mL1。该病理模型实验条件稳定,对病原的反应一致,重复性好。4.鱼腥草提取物体内抑制鸡胚感染模型的有效性及免疫学机理研究。(1)组织切片结果表明,MG感染机体后,主要侵染肺组织,造成肺脏组织结构遭到破坏,肺泡间隔增厚,肺泡腔缩小,肺泡壁扩张充血,肺泡腔水肿,炎性细胞浸润等病理变化。经鱼腥草提取物治疗后,各组肺脏组织结构均有不同程度的改善,组织结构恢复正常,仅有少量炎性细胞侵润。(2)PCR方法检测鱼腥草提取物对鸡胚肺脏组织中病原的抑制作用,结果表明,挥发油组和总黄酮组在体内对MG有一定的抑制作用,抑制率为66.7%。(3)荧光定量PCR技术检测IL-4、IL-6、IL-12、IFN-y等细胞因子的表达情况。与感染对照组比较,挥发油组中,脾脏IL-12mRNA的表达显著提高(P<0.05),脾脏FN-γmRNA的表达提高,IL-4mRNA的表达降低；总多糖组中,脾脏IFN-ymRNA的表达显著提高(P<0.05),IL-12mRNA的表达升高；总黄酮组中,高表达的IL-4、IL-6mRNA的表达降低,IFN-y和IL-12mRNA的表达无影响；三种提取物均降低脾脏中IL-4mRNA的表达,但与感染对照组差异不显著(P>0.05)；鱼腥草提取物降低脾脏中IL-6mRNA的表达,与感染对照组差异不显著(P>0.05)。与感染组相比,各有效部位对IL-4、IL-6mRNA有降低作用；对IFN-γ、IL-12mRNA具有升高作用。(4)流式细胞术技术检测脾T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+T细胞百分率变化。攻毒组CD4+和CD8+T淋巴细胞指标明显下降,与正常对照组比较,统计学差异显著(P<0.01),挥发油组与感染对照组相比较,差异显著(P<0.05),其他各组CD4+和CD8+T淋巴细胞指标与感染组比较均有上升,但无统计学差异。结论：(1)本研究提取了鱼腥草总多糖、总黄酮、挥发油三个有效部位。(2)建立了流式细胞术快速药敏试验方法,筛选得到鱼腥草体外抑制鸡毒支原体感染的有效部位为挥发油。(3)建立了鸡毒支原体感染的鸡胚模型。(4)本研究体内试验结果表明：①挥发油可能为体内抑制MG感染的有效部位,其可能的作用途径为促进机体细胞免疫,主要增强Th1类细胞因子IFN-γ、L-12mRNA的表达,抑制Th2类细胞因子IL-4mRNA的表达,从而重建Thl/Th2反应的平衡,实现对免疫功能的调节,产生抑制MG感染的药效。②总黄酮和总多糖也具有一定的免疫调节作用。总黄酮可能是通过提高CD4+T细胞比例,促进机体细胞免疫,降低高表达的IL-4、IL-6mRNA的表达,偏向Th2反应发挥免疫调节作用；总多糖通过显著提高脾脏中IFN-ymRNA的表达,升高IL-12mRNA的表达,主要偏向Th1反应发挥免疫调节作用。
【作者】孙俊颖；
【导师】吴清和；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】鱼腥草；鸡毒支原体；有效部位；流式细胞术；免疫机理；

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